Plateforme de génomique

La plateforme de génomique de l’UMR8199

La plateforme de génomique LIGAN-PM (Lille Integrated Genomics Advanced Network for personnalized medicine) a pour objectif d’offrir aux équipes de recherche publique et privée un ensemble complet d’outils et de compétences pour simplifier l’étude de la génétique, de la génomique et de la transcriptomique. Nos solutions intégrées visent à résoudre les défis d’analyse génétique et à accélérer le rythme des découvertes. Cette plateforme labellisée IBISA regroupe un ensemble technologique de haute qualité capable de répondre à des projets (moyen/haut débit) de génotypage, de séquençage et d’analyses bioinformatiques et biostatistiques.

Service

L’expérience d’une équipe pour la mise en place et l’accompagnement des projets de génomique et transcriptomique, le choix des technologies appropriées pour ces projets, la formation et le développement des technologies en fonction des nouveautés du marché. Le personnel technique assure le bon fonctionnement des équipements et organise notre activité en fonction des projets de recherche et des prestations de service de la plateforme.

Équipements et prestations

Notre laboratoire est équipé des technologies les plus performantes et innovantes dédiées à la génomique. Nous sommes ainsi capable de répondre à l’ensemble des demandes dans ce domaine, qu’il s’agisse de la préparation robotisée de librairies en vue du séquençage haut débit, que ce soit pour des projets de séquençage d’exomes, de séquençage ciblé, de séquençage de génome et aussi de métagénomique, le séquençage De Novo ou la détection de mutations. Notre expertise s’étend jusqu’à l’analyse bioinformatique et/ou bio-statistique de vos données. Liste des publications associées aux équipements de l’UMR8199.

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Les équipements dédiés au séquençage et au NGS

  • Hiseq 2500, Hiseq 4000, Nextseq 500, Miseq, CBot – Illumina

Illumina offre des plateformes innovantes de séquençage de nouvelle génération (NGS) lesquelles génèrent des données de qualité, à une échelle sans précédent. Le NGS permet le séquençage rapide d’ADN génomiques. Les derniers séquenceurs ADN d’Illumina permettent une grande variété d’utilisations, et peuvent produire de quelques gigabases à plus d’un terabase de données en un seul run de séquençage.

Le séquençage via les plate-formes Illumina permet un large éventail d’applications, telles que le séquençage de l’ensemble du génome, le séquençage de novo, le séquençage de région ciblée, la découverte de mutations, et l’identification des variations du nombre de copies.

Applications

  • Séquençage complet du génome (WGS): pour caractériser des génomes entiers de toutes tailles
  • séquençage d’Exome (WES): séquençage des régions codantes, peut être envisagé comme une alternative rentable au WGS
  • re-séquençage & séquençage ciblé : séquençage spécifique de panels de gènes d’intérêt
  • séquençage de novo: Séquence et assemblage de nouveaux génomes
  • séquençage mitochondrial: séquençage réalisé en vue de détecter des mutations associées à des maladies mitochondriales
  • séquençage de transcriptomes
  • Epigénétique : séquençage des régions méthylées du génome après transformation bisulfite
  • Métagénomique : séquençage des sous unités 16S / 18S afin de caractériser les population microbiennes

Le Miseq est dédié à de petits génomes, au reséquençage d’amplicons ou séquençage ciblé
Les plate-formes Nextseq500 et HiSeq 2500 et HiSeq 4000 sont dédiées au séquençage de génomes, exomes, transcriptome.

CBotNextseqMiseqHiseq

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  • E220 – Covaris

Le Covaris E220 est un appareil à ultrasons ciblées conçus pour le traitement des échantillons pour de nombreuses applications biologiques et chimiques, y compris, l’ADN et la chromatine, l’homogénéisation des tissus, la lyse cellulaire, dissolution, et la micronisation de particules.

L’utilisation de l’énergie acoustique (Adaptive Focused Acoustics™) permet le traitement de 1 à 96 échantillons avec précision et exactitude avec des échantillons de volumes variables.

covaris e220

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  • Star – Hamilton & Bravo – Agilent

Les automates STAR (Hamilton) et Bravo Automated Liquid Handling Platform (Agilent) sont des automates de pipetage dédiés aux préparations de librairies et captures pour le séquençage de nouvelle génération. Nous pouvons automatiser les protocoles des librairies TRuSeq DNA et RNA, KAPA DNA, les librairies d’amplicons Haloplex ainsi que les captures Nimblegen et Agilent, pour de l’exome entier ou de la séquence ciblée.

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  • Pyromark Q24 advanced – QIAGEN
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Le PyroMark Q24 Advanced a amélioré la technologie de pyroséquençage et fournit, par rapport aux modèles précédents, une meilleure détection des bases en temps réel, ainsi qu’une meilleure quantification. Le PyroMark Q24 Advanced est doté d’une technologie de pointe. Il est idéal pour analyser les variations de séquence, mais plus particulièrement la méthylation d’ADN au niveau des sites CpG ou CpN. Le nouveau mode CpN du PyroMark Q24 Advanced permet désormais l’analyse de la méthylation des résidus cytosine qui ne font pas partie des ilôts CpG.

Le PyroMark Q24 Advanced permet une meilleure quantification de la méthylation dans les runs comportant de longues séquences et ce, pour n’importe quelle position dans la séquence. Précédemment, l’analyse des sites de méthylation situés assez loin du primer pouvait être incertaine, mais maintenant avec une lecture de séquences plus longues ainsi qu’une plus grande précision, la quantification de la méthylation est véritablement fiable tout au long de cette séquence.

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  • Access array – Fluidigm

Grâce à une combinaison unique de circuits fluidiques intégrés, l’Access Array génère des bibliothèques d’amplicons en utilisant un protocole de marquage unique dans lequel sont attachés, pour chaque produit PCR, des amorces contenant les séquences des codes-barres spécifiques aux échantillons et les séquences spécifiques au séquenceur. Le multiplexage des amorces permet de construire des bibliothèques de 480 amplicons par échantillon, et les codes-barres permettent de multiplexer jusqu’à 384 échantillons dans un seul run de séquençage.

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  • SPRIworks SPRI-TE – Beckman

Le SPRI-TE est un automate de préparation de librairie pour le séquençage de nouvelle génération Illumina ou Roche. Basé sur la technologie de purification par billes magnétiques (SPRI), il permet une sélection différentielle de la taille du fragment généré et le traitement jusqu’à 10 librairies en 5 heures.

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  • Thunderstrom – Raindance
TStorm-Raindance

Le Thunderstorm de la société Raindance est une solution NGS d’enrichissement entièrement automatisée à haut débit qui permet d’analyser jusqu’à 96 échantillons en 48 heures et d’accéder à un maximum de huit panels d’amorces différentes. Le Thunderstorm est basé sur la technologie Raindance qui génère des millions de réactions PCR sous forme de picogouttelettes lipidiques permettant de cibler jusqu’à 20 000 loci pour un seul échantillon. Le système est compatible avec toutes les plateformes NGS (séquenceurs Illumina, séquenceurs Roche, Life Technologies séquenceurs, et PacBio RS).

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  • Bioanalyzer 2100 – Agilent
Bioanalyser

Le bioanalyseur Agilent 2100 est la norme standard pour les contrôles qualité d’échantillon tels que l’ARN et a remplacé l’électrophorèse sur gel, laborieuse. Il a également remplacé rapidement l’électrophorèse sur gel pour l’analyse de fragment d’ADN et l’analyse SDS-PAGE des échantillons de protéine.

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  • GS Junior – Roche
GSJunior

Le séquenceur de paillasse GS junior combine l’efficacité de la technologie de séquençage 454 (Roche) avec la taille d’un petit équipement. Via la chimie Titanium, un run permet de générer 35 Mbases de données en 10 heures avec une taille de fragment moyenne de 400 pb. De nombreuses applications sont disponibles avec ce système : le séquençage de librairies d’amplicons, de captures, et d’exome entier ainsi que de la transcriptomique et de la metagenomique.

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Les équipements dédiés au génotypage, à la ddPCR, QPCR, à la protéomique, et aux études d’expression

  • iScan – Illumina

Le scanner iScan permet une large gamme d’applications pour des analyses génétiques, y compris :

  • Génotypage : Génotypage Illumina grâce aux puces à ADN pour étude GWAS. Les applications du génotypage :
  1. SNP et analyse CNV
  2. Analyse de lien
  3. Génotypage ciblé
  • Analyse d’Expression de gènes : les puces de gene expression fournissent une vue globale de l’activité des gènes dans les cellules. La technologie BeadArray permet de mesurer de manière robuste et précise l’expression de ces gènes.
  • Analyse d’échantillons FFPE : Les échantillons fixés dans le formol et incorporés dans la paraffine (FFPE) sont des échantillons tissulaires préservés qui contiennent généralement de l’ARN partiellement dégradé, rendant l’analyse de transcription plus compliquée. Illumina offre des solutions pour garantir des résultats de puces de haute qualité malgré la dégradation de ces ARN.
  • Analyse de la méthylation : Les puces épigénétiques vous permettent de parcourir quantitativement les sites de méthylation à travers le génome, en utilisant le multiplexage pour un rendement maximum. La gamme Infinium Methylation Assay d’Illumina couvre les îlots CpG, les régions promotrices des miRNA et d’autres zones importantes dans les régulations épigénétiques.
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  • Odyssey – LICOR

Ce système repose sur une détection dans l’infrarouge, qui permet une quantification précise sur une gamme de près de 4 log et une augmentation de la sensibilité en raison de l’absence de bruit de fond de la plupart des supports.L’Odyssey est équipé de deux lasers, permettant une détection en multiplexe sur deux longueurs d’ondes (autour de 700 et 800 nm).Des applications immédiates sont la normalisation des résultats sur la même membrane (avec un gène de ménage), ou bien la détection simultanée d’une protéine et de sa forme phosphorylée.

Enfin, outre le western “classique”, l’Odyssey est utilisable pour beaucoup d’autres applications.

En particulier, il est possible de réaliser des expériences d’immunodétection “in-cell” afin de détecter de façon quantitative une protéine sur des cellules fixées, en microplaques de 24 ou 96 puits par exemple. Cela permet d’étudier les voies de signalisation, de faire du screening sans artéfact dû à la lyse cellulaire.

On peut également compter directement les cellules via un marquage des noyaux avec Draq5.

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  • Glomax multi – Promega
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Le système de détection multi-GloMax® Promega peut fonctionner comme un luminomètre (mesure d’activité luciférase) ou un photomètre (dosage protéique) pour plaques 96 puits. Rapidité de lecture, facile d’utilisation. Export des données en format csv.

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  • QX200 Droplet digital PCR system – BIORAD

Le système de PCR digitale en gouttelettes QX200 Droplet Digital PCR de bioRad TM permet une quantification absolue de l’ADN ou de l’ARN ciblé pour des applications basées sur une technologie Evagreen ou par sondes d’hydrolyse TaqMan TM. Les applications sont nombreuses telles le calcul du nombre de copies d’une cible (CNV), la quantification absolue, la quantification de librairies NGS, la détection de mutations rares et de séquences rares, l’expression de gènes, l’analyse des micro ARN et l’analyse de cellule unique. Le QX200 Droplet generator partitionne chaque échantillon en 20000 gouttelettes lipidiques. Aprés amplification, les gouttelettes sont lues en 3 heures sur le QX200 Droplet reader, qui compte les gouttelettes fluorescentes positives et négatives afin de calculer la concentration de l’ADN ciblé.

QX200 ddPCR

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  • BioMark HD – Fluidigm
Biomark

Les circuits Intégrés de Fluidique (IFC) permettent l’automatisation des réactions de PCR en nanovolumes, minimisant ainsi la quantité d’échantillons et de réactifs. Le système Biomark HD fonctionne soit en temps réel soit en point final, apportant ainsi des solutions flexibles, efficaces et économiques à une large gamme d’applications dans le domaine de la PCR. Dans le laboratoire, nous utilisons quatre IFC:
– 96.96 : 96 cibles contre 96 échantillons à la fois.
– 48 .48 : 48 cibles contre 48 échantillons à la fois.
– 192.24 : 24 cibles contre 192 échantillons à la fois.
– FLEXsix: six partitions (12 cibles par 12 échantillons) qui peuvent être exécuté séparément ou ensemble.Avec ces quatre IFC, nous pouvons réaliser des études de Gene Expression ou de Génotypages.Nous réalisons également au laboratoire l’étude de polymorphisme “Copy number variation” (CNV). Pour cela nous utilisons la “Digital Array IFC” qui divise l’échantillon dans 765 ou 770 chambres de 6 nanoLitre dans lesquelles se fait la réaction de qPCR.La concentration de l’ADN cible (copies/ul) peut être calculé en utilisant le nombre de chambres positives, qui contiennent au moins une copie de la séquence d’ADN étudiée. Pour ce type d’étude, nous avons deux types d’IFC:
– 12.765 : 12 échantillons dans 765 chambres
– 48.770 : 48 échantillons dans 770 chambres

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  • nCounter analysis – Nanostring
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Le nCounter Analysis System de NanoString, est une manière simple et rentable d’établir le profil de centaines d’ARNm, de microARN, ou d’ADN simultanément, offrant haute sensibilité et précision. La détection numérique de molécules cibles et les hauts niveaux de multiplexage éliminent le choix entre la qualité et la quantité de données. Le système de NanoString utilise des codes barres moléculaires pour détecter et compter des centaines de transcrits uniques dans une réaction seule. Contrairement à d’autres méthodes, le protocole n’inclus pas d’amplification qui pourrait représenter un biais pour les résultats. Le système se divise en deux éléments :

  • La nCounter Prep Station :. Elle traite les échantillons pour les préparer à la collecte de données sur le nCounter Digital Analyser. Avant de placer les échantillons sur la Prep Station, ceux-ci sont hybridés selon le protocole nCounter. Puis, ils sont purifiés et immobilisés par la suite dans la cartouche pour la collecte de données. La Prep Station peut traiter jusqu’à 48 échantillons dans un laps de temps de 10 heures.
  • Le nCounter Digital Analyser : il collecte les données en prenant des photos des reporters fluorescents immobilisés dans la cartouche avec un appareil photo CCD via une lentille de microscope. Les images sont traitées par la machine et les donnnées fournies incluent l’identifiant cible et le nombre de comptage ainsi que le nombre de comptage pour les contrôles internes, ce qui permet à chaque essai d’être quantitatif.

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  • Seahorse XFe24 – Seahorse Bioscience

Les analyseurs Seahorse XFe24 mesurent simultanément la respiration mitochondriale (consommation d’oxygène) et la glycolyse (libération d’ion H+) en utilisant des microcapteurs optiques non invasifs. Doté d’une microchambre transitoire, le XFe24 permet de réaliser des mesures précises, non invasive, non destructives sur 24 échantillons simultanément avec l’injection automatique séquentielle de 4 drogues permettant d’étudier spécifiquement différents complexes mitochondriaux. L’un des avantages du XFe24 est qu’il est utilisable non seulement sur des monocouches de cellules primaires adhérentes (différencies ou non), des lignées cellulaires, des cellules non adhérentes, sur des mitochondries isolées mais également sur des îlots isolés de pancréas, permettant une analyse précise de la fonction mitochondriale dans différents contextes tissulaires.

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  • Viia7 Real Time PCR System – Life Technologies

Le nouveau système VIIa 7 est un système de PCR en temps réel de 7e génération qui permet une productivité élevée de qPCR grâce à sa flexibilité, ses spécificités et ses performances.

1°) Détermination de la concentration d’une cible nucléique grâce à une courbe de concentration contrôle (courbe de standard). Utilisation de sondes TaqMan spécifiques ou de SYBR Green.

2°) Détermination de la concentration relative d’un échantillon ou d’une cible grâce à une courbe de standard et un contrôle endogène. Les mesures de concentrations sont ainsi normalisées en utilisant le contrôle endogène. Utilisation de sondes TaqMan spécifiques. Cette méthode peut-être utilisée pour :

  • comparer l’expression d’un gène au sein de différents tissus.
  • comparer l’expression d’un gène dans un échantillon traité et un autre échantillon non traité.
  • comparer l’expression d’un gène avec l’allèle sauvage par rapport à l’allèle muté.
  • Comparer l’expression d’un gène en fonction du temps sous différentes condition de traitements

3°) Détermination du génotype d’un variant génétique (SNP or Insertion /Déletion) soit en temps réel (Real Time PCR) soit en point final à la fin de la réaction de PCR. Utilisation de sondes TaqMan spécifiques.

4°) Détermination de la présence ou l’absence de l’expression d’un gène dans un échantillon. Réalisation d’une PCR avec deux sondes TaqMan spécifiques à un contrôle interne et au gène d’intérêt.

5°) Détermination de la température de fusion d’une cible nucleïque (TM). Réalisation d’une courbe de fusion par un gradient de température en présence de SYBR Green à l’issue de la PCR. Détermination de la présence ou de l’absence d’amplificats contaminants.

Pour chaque point, l’étude peut se faire soit sur 96 échantillons soit sur 384 échantillons.

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  • TLDA – Life Technologies
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TLDA pour TaqMan Low Density Array est un système qui permet de déterminer rapidement par quantification relative le profil d’expression d’un grand nombre de gènes ou de miRNA sur plusieurs échantillons dans un volume de réaction réduit (2 µl : 1 µl d’échantillon et 1 µl de mix réactionnel).

Des sondes TaqMan sont introduites dans une plaque de 384 puits.

Il existe deux types de plaque 384 :

  • Celle sur mesure, customisée au sein de laquelle on inclut les sondes TaqMan qui nous intéressent.
  • Celle prédéfinie pour un diagnostic scientifique ou médical

 

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Analyse bioinformatique et analyse biostatistique

Les volumes et la qualité des données produites par les nouvelles générations de séquenceurs changent régulièrement. Notre Laboratoire s’adapte régulièrement et propose le développement d’utilitaires pour vous répondre et obtenir le meilleur de vos données : assemblage, étude des transcriptomes, analyse d’exomes et de génomes, statistiques.

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